線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書

微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F₁F₀-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
測(cè)定原理：
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測(cè)定Pi增加速率來測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：80mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：2mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入2mL蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;
試劑五：8mL×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入4mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；
試劑九：液體 10mL×1 瓶，室溫保存。
定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿 600g，4℃離心 5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選
做）。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入800uL試劑二和8uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、 酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

試劑名稱（μL）	對(duì)照管	測(cè)定管
試劑四	20	20
試劑五	80	80
樣本		100
混勻， 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴 30min
試劑六	40	40
樣本	100

混勻，4000g，25℃離心 10min，取上清液
2、 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑）

上清液	30	30
定磷試劑	170	170

混勻，室溫靜置10min后，在660nm處讀取A測(cè)定管和A對(duì)照管，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y為A 值。
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/10⁴cell）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×10⁶]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L； V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y 為A 值。
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×10⁶]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/g 鮮重）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×10⁶]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /10⁴cell）=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×10⁶]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.4×10^-4 L；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。