一 樣品準(zhǔn)備
1 細(xì)胞樣品：將需要抽提的蛋白的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，吸去培液，適量預(yù)冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4℃充分裂解細(xì)胞，將細(xì)胞刮入1.5ml EP管中，95℃以上加熱10分鐘，12000g離心 10 分鐘，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于 -80℃冰箱。
2 組織樣品：
新鮮組織：將組織剪成細(xì)小的碎片，按每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12000g 離心15分鐘，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱。
冷凍組織：于-80℃冰箱中取出適量的組織在液氮中迅速研磨成粉末，將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移到含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液的離心管中，4℃ 12000g 離心15分鐘，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱。
蛋白定量
1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一塊酶標(biāo)板，按照下表加入試劑
| 孔號(hào) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
| 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（μl） |
0 |
2 |
4 |
6 |
8 |
12 |
16 |
20 |
| 去離子水（μl） |
20 |
18 |
16 |
14 |
12 |
8 |
4 |
0 |
| 對(duì)應(yīng)蛋白濃度（μg/μl） |
0 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
2. 根據(jù)樣品數(shù)量，將BCA試劑A與試劑B按體積比為50:1配制適量BCA工作液，充分混勻；
3. 各孔加入180μl BCA工作液；
4. 把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測(cè)定吸光度。以吸光值為橫坐標(biāo)，蛋白濃度（μg/μl）為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
5. 在酶標(biāo)板中加入2μl待測(cè)蛋白和18μl PBS（稀釋10倍），加入180μl BCA工作液，把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測(cè)定吸光度，每個(gè)樣本重復(fù)做兩個(gè)孔。
6. 根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白濃度（μg/μl），乘以樣品稀釋倍數(shù)（10）即為樣品實(shí)際濃度（單位：μg /μl）。
三 PAGE膠的制備
1. 下層分離膠的制備
根據(jù)目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度，高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離。不同濃度的分離膠按下表進(jìn)行配制，待下層膠凝固后進(jìn)行上次濃縮膠的配制。
2. 上層濃縮膠的配制
根據(jù)需要按下表配制濃縮膠，并插好梳子。
四 上樣及電泳
1. 上樣
每孔上樣量為20-40μg蛋白，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求加大上樣量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10min后離心取上清上樣。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，取下梳子用槍輕輕吹打加樣孔，避免孔內(nèi)有余膠殘留影響上樣。將準(zhǔn)備好的樣品用加樣槍慢慢加到對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，注意勿溢出加樣孔。
2. 電泳
一般濃縮膠80V 20分鐘，分離膠120V 60分鐘，可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整電壓和時(shí)間。當(dāng)染料到達(dá)膠底部時(shí)切斷電源，停止電泳，進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜。
五 轉(zhuǎn)膜
轉(zhuǎn)膜分為濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)，一般分子量小于100KD選擇半干轉(zhuǎn)。濕轉(zhuǎn)膜三明治排列為：海綿
/慮紙
/膠
/膜
/慮紙
/海綿，全部緊密排列，特別是膠
/膜之間不能留有氣泡，三明治安放的方向?yàn)樨?fù)極為膠，正極為膜，帶負(fù)電的蛋白由負(fù)極向正極方（膜）遷移。30V轉(zhuǎn)膜30分鐘，可以根據(jù)膠的厚度以及蛋白的大小增加轉(zhuǎn)膜時(shí)間。標(biāo)準(zhǔn)的電轉(zhuǎn)緩沖液為1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果轉(zhuǎn)膜的蛋白分子量大于80KD，則推薦加入SDS 使之終濃度為0.1%。
半干式轉(zhuǎn)膜中，三明治的排列為：
/慮紙
/膠
/膜
/慮紙，用電轉(zhuǎn)緩沖液浸濕后，直接置于電轉(zhuǎn)儀的正負(fù)極之間。膠于負(fù)極而膜置于正極。半干式的電轉(zhuǎn)緩沖液不同于濕式的電轉(zhuǎn)緩沖液，推薦為：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V轉(zhuǎn)膜30分鐘即可。轉(zhuǎn)膜前將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分鐘，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5 分鐘，膠也需在冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡3-5 分鐘，否則轉(zhuǎn)膜時(shí)會(huì)導(dǎo)致條帶變形。
六 膜上蛋白的檢測(cè)
為檢測(cè)轉(zhuǎn)膜是否成功，可用麗春紅染色，麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：10 稀釋，即加9 倍的ddH
2O
染色方法：將膜放入TBST 洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下?lián)u動(dòng)染色5 分鐘，大量的水洗膜直至水變清無(wú)色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST 或水重新洗后再進(jìn)行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進(jìn)行封閉。
七 膜的封閉及抗體孵育
1. 封閉：5%脫脂奶粉（檢測(cè)磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1小時(shí)或4℃過(guò)夜。
2. 一抗：不同公司生產(chǎn)的一抗?jié)舛炔煌鶕?jù)說(shuō)明書稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2小時(shí)或4 ℃孵育過(guò)夜。
3. 二抗：孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5min。隨后根據(jù)用量，ECL法按10ml抗體稀釋液加入5μlHRP標(biāo)記二抗（1:2000），與膜374℃孵育1h。用TBST洗滌3次，每次5min。
八 顯色
ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：配制ECL發(fā)光液，根據(jù)用量，取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5分鐘。倒掉顯色液，用紙小心吸取顯色液，在上面蓋上一層平整的透明紙。暗室中打開(kāi)紅外燈，取出感光膠片做好標(biāo)記，輕輕放在膜上，顯色30-60s，拿開(kāi)膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，在放入定影液中1min，離開(kāi)暗室觀察結(jié)果。可以根據(jù)條帶強(qiáng)弱再次感光或減短感光時(shí)間已達(dá)到理想結(jié)果。
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