cck-8試劑盒、細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 CCK-8試劑盒 Cell Counting Kit-8 CK04 檢測(cè)原理： ◆ Cell Counting Kit簡(jiǎn)稱CCK8,(CCK-8/WST-8)試劑盒，是一種基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝***基)-3-(4-硝***基)-5-(2,4-二磺基***)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。 ◆ WST-8屬于MTT的升級(jí)產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450mM波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。 ◆ CCK法應(yīng)用非常廣泛，如藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)以及生物因子的活性檢測(cè)等。 CCK-8試劑盒 Cell Counting Kit-8 CK04 CCK方法的優(yōu)勢(shì)： ◆ 表1 CCK法與其他細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)比較 檢測(cè)方法 MTT法 XTT法 WST-1法 CCK法 甲臜產(chǎn)物的水溶性 差（需加有機(jī)溶劑溶解再檢測(cè)） 好 好 好 產(chǎn)品性狀 粉末 2瓶溶液 溶液 1瓶溶液 使用方法 配成溶液后使用 現(xiàn)配現(xiàn)用 即開即用 即開即用 檢測(cè)靈敏度 高 很高 很高 高 檢測(cè)時(shí)間 較長(zhǎng) 較短 較短 最短 檢測(cè)波長(zhǎng) 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm 細(xì)胞毒性 高，細(xì)胞形態(tài)完全消失 很低，細(xì)胞形態(tài)不變 很低，細(xì)胞形態(tài)不變 很低，細(xì)胞形態(tài)不變 試劑穩(wěn)定性 一般 較差 一般 很好 批量樣品檢測(cè) 可以 非常適合 非常適合 非常適合 便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷 ◆ 酚紅和血清對(duì)CCK法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾； ◆ 細(xì)胞毒性非常低，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀數(shù)從而找到最佳測(cè)定時(shí)間。 CCK法的操作步驟（更多內(nèi)容請(qǐng)見說(shuō)明書）： 實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞活性檢測(cè) 1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃,5% CO2）。 2、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。 3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。 4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。 5、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。 實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè) 1、在96孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（37℃，5% CO2）。 2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。 3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。 4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。 5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。 6、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。 7、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。 注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。 活力計(jì)算： 細(xì)胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100 A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度 A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度 *細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力 CCK-8試劑盒 Cell Counting Kit-8 CK04保存條件： 4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存兩年有效。 Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）是由同仁化學(xué)研究所（Dojindo）開發(fā)的檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性的試劑盒，為MTT法的替代方法，試劑盒中采用自己開發(fā)的水溶性四唑鹽-WST-8，在美國(guó)，歐洲等國(guó)家地區(qū)均持有專利，同仁化學(xué)研究所于2006年在中國(guó)獲得了WST-8的注冊(cè)商標(biāo)。 CCK-8法與普通的MTT法相比，具有顯著特點(diǎn)： ★靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好 ★操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力 ★水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細(xì)胞 ★無(wú)需***性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低 ★為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用 ★適合于高通量藥物篩選 CCK-8用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn) CCK-8試劑盒在國(guó)內(nèi)知名科研院所、重點(diǎn)大學(xué)、三甲醫(yī)院被廣泛應(yīng)用，國(guó)際認(rèn)可度高，使用CCK-8發(fā)表的中外文獻(xiàn)達(dá)600多篇，其中截止08年底SCI影響因子IF＞10分的論文有37篇，最高IF26.5分 [Heterozygosity with respect to Zfp148 causes complete loss of fetal germ cells during mouse embryogenesis,Nature Genetics 33, 172 - 176 (01 Feb 2003)] CCK-8試劑與MTT等方法靈敏度比較 CCK-8試劑毒性：CCK-8和其他檢測(cè)方法對(duì)比可以得出——CCK-8對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，不傷害細(xì)胞，細(xì)胞可重復(fù)利用