產品類別：外周血NK細胞的分離
 
產品編號：NK2011M
 
產品名稱：小鼠外周血NK細胞分離液試劑盒
 
產品規(guī)格：2X200ml/Kit
 
產品價格：￥800.00元
 
本品用于分離小鼠外周血NK細胞



“XXXX”動物外周血 NK 細胞分離液實驗方法
 
 
 
技術文檔編號：TBD0038SOP
 
【產品規(guī)格】
 
2×200ml/Kit
 
【產品組成】
 
為方便廣大用戶使用，試劑內容如下：
 

	名稱	產品編號	規(guī)格
A	分離液 1		200ml
B	分離液 2		200ml
C	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
D	說明書		1 份

 
【實驗前準備】
 
適用儀器：最大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機
 
【檢驗方法】
 
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
 
方法一（需留取血漿備用）
 

• 首先取抗凝血 250g 離心 10min，棄血漿，補加胎牛血清（添加量與棄去血漿量等同）制成細胞懸液，根據(jù)細胞懸液液體體積，選擇適當離心管進行試驗。

 

• 取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細胞懸液體積比為 2：1。如細胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

 

• 用吸管小心吸取細胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色 NK 細胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層（下層 50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細胞層。第六層為紅細胞層。

 

• 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產品

 
 
編號：2010X1118），混勻細胞。
 

• 250g，離心 10min。

 

• 棄上清。

 

• 用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

 

• 250g，離心 10min。

 

• 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。

 
分離圖例：
 
 
 
 
方法二（不需血漿留存?zhèn)溆茫?br />  

• 根據(jù)新鮮抗凝全血樣本量選取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與抗凝血體積比為 2：1。如抗凝血為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最低不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。
• 用吸管小心吸取抗凝血加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時離心管中由上至下分為六層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色 NK 細胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細胞層。第六層為紅細胞層。

 

• 后續(xù)步驟同方法一。

 
【差異貼壁法純化細胞】
 
 
（1）用 NK 細胞無血清培養(yǎng)基（產品編號：CNK2015）或 NK 細胞完全培養(yǎng)基（產品
 
編號：HCNK2015）以 1.5-3×10⁶ 個/ml 的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次性細胞板或細
 
胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。
 
（2）2-4 小時內貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）。
 
（3）10-24 小時內貼壁的單個核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。
 
（4）不貼壁的為淋巴細胞。
 
注：
 

• 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。

 

• 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細胞而定）。

 

• 由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。

 
【注意事項】
 

• 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結果，最好在取血 2h 內進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

 

• 本實驗最好不要使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。

 

• 吸取過多的目的細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。

 

• 吸取過多的目的細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。

 

• 如所實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術支持以尋求幫助。

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
 
本實驗 NK 細胞提取率大于 80%。
 
 

	下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當進行參考。
		紅細胞		白細胞			血小板
			（4.0-10.0）×109
	含量（個/L）	（4.0-5.5）×1012	中性粒細胞	淋巴細胞		單核細胞	（1.0-3.0）×1011
			50%-70%	20%-40%		3%-8%
	【相關實驗技術方案】

 

• 所獲得 NK 細胞的培養(yǎng)技術。

 

• 所獲得 NK 細胞的核酸提取技術。

 

• 所獲得 NK 細胞的鑒定方法A.流式細胞技術B.免疫組化技術C.原位雜交技術

 
D.PCR 技術
 
 
【可能存在的問題及解決方法】
 
1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
 

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案
離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層	轉速過小或離心時間過短	適當增減轉速
離心后目的細胞存在于分離液中	轉速過大或離心時間過長
離心后白環(huán)層彌散	細胞密度過大	調整細胞密度
離心后白環(huán)層太淺或看不見	細胞密度過小

 

• 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離心時間，對離心轉速進行調整。

 

• 本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可

 
能出現(xiàn)紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉速。
 
注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到最佳分離效果，離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。