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產(chǎn)品信息：
產(chǎn)品介紹：
pBM18ATopotsmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構(gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中，不僅適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chǎn)物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產(chǎn)物。陽性克隆可用M13F(-47)和M13R(-48) 引物進行菌落PCR鑒定。SmaI和XhoI單酶切可將克隆片段酶切出來。載體的多克隆位點兩側(cè)具有SP6和T7 RNA聚合酶啟動子序列， 可用于體外RNA轉(zhuǎn)錄。載體不含LacZ基因，不能進行藍白斑篩選。
2. PCR 引物 5’端不能進行磷酸修飾，普通商業(yè)化引物即可。
3. 載體采用了新的制備工藝，無需藍白斑篩選。
4. 載體具有氨芐青霉素抗性。操作步驟
產(chǎn)品信息：
| 組分 | JCL073-01 (20次) | JCL073-02 (20次×3) |
| pBM18A Vector (20ng/ml ) | 20ml | 20ml×3 |
| 10×Toposmart | 20ml | 20ml×3 |
| Control Insert LacZα | 5ml | 5ml |
| M13F(-47) Primer | 0.1OD | 0.1OD×3 |
| M13R(-48) Primer | 0.1OD | 0.1OD×3 |
pBM18ATopotsmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構(gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中，不僅適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chǎn)物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產(chǎn)物。陽性克隆可用M13F(-47)和M13R(-48) 引物進行菌落PCR鑒定。SmaI和XhoI單酶切可將克隆片段酶切出來。載體的多克隆位點兩側(cè)具有SP6和T7 RNA聚合酶啟動子序列， 可用于體外RNA轉(zhuǎn)錄。載體不含LacZ基因，不能進行藍白斑篩選。
產(chǎn)品特點：
1. 使用各種DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物。2. PCR 引物 5’端不能進行磷酸修飾，普通商業(yè)化引物即可。
3. 載體采用了新的制備工藝，無需藍白斑篩選。
4. 載體具有氨芐青霉素抗性。操作步驟
1. 連接反應
按下表，在一個 0.2ml PCR 管中依次加入| 成分 | 體積 |
| DNA 片段 | 0.5-8ml |
| pBM18A Vector | 1ml |
| 10×Toposmart | 1ml |
| 補水至總體積 | 10ml |
加完試劑后，輕輕混勻低速離心，使溶液集中在管底。注意：此步驟不要在低溫條件下（冰水浴）上操作。
注意：DNA 片段的用量見下表
室溫下（20-30℃）反應時間 5-30 分鐘，如果室溫較低，推薦使用 PCR 儀控溫。可以設置 25℃反應 5-30 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶， 無引物二聚體和非特異性條帶存在，可直接取 0.5-1ml 的 PCR 產(chǎn)物原液進行克隆。
20-30 分鐘。
（2）42℃水浴中熱擊 30 秒。
（3） 立刻置于冰水浴中 2 分鐘。
（4） 加入 300-500μl 無菌的不含抗生素的SOC 或 LB，37℃，200-250rpm 振蕩培養(yǎng) 60 分鐘。
注：小于 2kb 片段可以不復蘇，直接涂平板。
（5） 吸取 200ml 菌液涂布。為了得到更多的菌落，可以先 4000rpm 離心 1 分鐘，去掉部分上清，用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液，取全部菌液涂布，然后37℃培養(yǎng)過夜（12-16 小時）。
5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR
（1） 菌落PCR方法鑒定陽性克隆
2. 反應溫度及片段要求
室溫下（20-30℃）放置 5-30 分鐘，然后將離心管放置在冰上。如當天不進行轉(zhuǎn)化實驗。請將連接產(chǎn)物置于-20℃保存。注意：DNA 片段的用量見下表
| 片段大小（bp） | 最佳用量（ng） |
| 100-1000 | 20-50 |
| 1000-2000 | 50-100 |
| 2000-5000 | 100-200 |
3. 陽性對照反應
取 1ml 試劑盒提供的 1kb 長度的對照片段 LacZ 基因 α肽片段進行克隆，轉(zhuǎn)化具有α互補功能的大腸桿菌感受態(tài)細胞（如 DH5α,TOP10,Mach1T1 等）。菌液涂布在含有 IPTG 和 X-gal 的 LB 氨芐平板上，次日藍色菌落為陽性克隆，說明有片段插入，白色菌落為空載體。4. 轉(zhuǎn)化
（1）取 5ml 連接產(chǎn)物到 50-100ml 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴20-30 分鐘。
（2）42℃水浴中熱擊 30 秒。
（3） 立刻置于冰水浴中 2 分鐘。
（4） 加入 300-500μl 無菌的不含抗生素的SOC 或 LB，37℃，200-250rpm 振蕩培養(yǎng) 60 分鐘。
注：小于 2kb 片段可以不復蘇，直接涂平板。
（5） 吸取 200ml 菌液涂布。為了得到更多的菌落，可以先 4000rpm 離心 1 分鐘，去掉部分上清，用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液，取全部菌液涂布，然后37℃培養(yǎng)過夜（12-16 小時）。
5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR
（1） 菌落PCR方法鑒定陽性克隆
① 用10ml吸頭挑選克隆至預先加有10ml無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中， 吹打混合。
② 25ml PCR反應體系：取2ml細菌懸液為模板、加入5mM 濃度的M13F(-47)、
M13R(-48)各1ml進行PCR擴增。
③PCR擴增條件：95℃預變性5分鐘（裂解細胞，失活核酸酶），94℃變性10秒鐘，55℃退火10秒鐘，72℃延伸（ 根據(jù)片段的大小決定延伸時間，通常每1min/1kb）X秒，30個循環(huán)，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，有強烈的明顯條帶的克隆為重組體，與插入片段大小相近【M13F(-47)、M13R(-48)引物在克隆位置的兩側(cè)，所以PCR 擴增出的DNA的長度比插入片段大229bp】可視為陽性克隆。菌落PCR 方法鑒定重組子時一定要設立一個不加菌液的陰性對照。
（2） 測序：用M13F(-47)、M13R(-48)通用引物對陽性質(zhì)粒進行測序分析。
pBM18A載體圖譜7. 常見問題分析
(1) 重組子克隆菌少，或陽性率低：感受態(tài)效率低，使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/μg 的感受態(tài)細胞
(2) 連接反應在低溫下（如放碎冰上）操作，應該在室溫下操作。
(3) PCR 片段加入量太多或太少，按照推薦量加入。
(4) PCR 純度低，重新擴增或重新純化 PCR 產(chǎn)物。
(5) PCR 質(zhì)量低，切膠時在紫外下照射時間長，需重新制備。
(6) PCR 擴增結(jié)束后，應該再延伸 5-10 分鐘，確保片段延伸完全。
(7) 轉(zhuǎn)化后沒有復蘇培養(yǎng)，可以加入SOC 或 LB，培養(yǎng) 60 分鐘。克隆基因可
② 25ml PCR反應體系：取2ml細菌懸液為模板、加入5mM 濃度的M13F(-47)、
M13R(-48)各1ml進行PCR擴增。
③PCR擴增條件：95℃預變性5分鐘（裂解細胞，失活核酸酶），94℃變性10秒鐘，55℃退火10秒鐘，72℃延伸（ 根據(jù)片段的大小決定延伸時間，通常每1min/1kb）X秒，30個循環(huán)，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果，有強烈的明顯條帶的克隆為重組體，與插入片段大小相近【M13F(-47)、M13R(-48)引物在克隆位置的兩側(cè)，所以PCR 擴增出的DNA的長度比插入片段大229bp】可視為陽性克隆。菌落PCR 方法鑒定重組子時一定要設立一個不加菌液的陰性對照。
（2） 測序：用M13F(-47)、M13R(-48)通用引物對陽性質(zhì)粒進行測序分析。
6.
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(1) 重組子克隆菌少，或陽性率低：感受態(tài)效率低，使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/μg 的感受態(tài)細胞
(2) 連接反應在低溫下（如放碎冰上）操作，應該在室溫下操作。
(3) PCR 片段加入量太多或太少，按照推薦量加入。
(4) PCR 純度低，重新擴增或重新純化 PCR 產(chǎn)物。
(5) PCR 質(zhì)量低，切膠時在紫外下照射時間長，需重新制備。
(6) PCR 擴增結(jié)束后，應該再延伸 5-10 分鐘，確保片段延伸完全。
(7) 轉(zhuǎn)化后沒有復蘇培養(yǎng)，可以加入SOC 或 LB，培養(yǎng) 60 分鐘。克隆基因可
能對宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和DNA 結(jié)合蛋白的基因，某些啟動子和調(diào)節(jié)序列基因，或含有倒置或串聯(lián)重復序列的基因，選用室溫過夜培養(yǎng)平板，或換用低拷貝質(zhì)粒載體。
載體序列：
>pBM18A 1952bp AAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA AAACGACGGCCAGCCAATTGAAGCTATTTAGGTGACACTATAGATATCGAGCTCGAGGATCCATGGTA
CCCGGGCGTGTCG CGACACGCCCGGGTCTAGACTGCAGCTCGAGGCATGCAAGCTTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCCATCCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCGT CCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAAC TTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAA GGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTC CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTG GGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCC AATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGC AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCAT CTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGC CAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATC ATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACC ACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTC CGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCA CTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGA TGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAAT GTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC CCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACC TGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTT ATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTAC GGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTT GGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGAT TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAG
本產(chǎn)品僅供研究，不用于臨床診斷
上海研謹生物是一家專業(yè)從事生化試劑、分子生物學試劑、實驗耗材及實驗儀器研發(fā)、銷售、服務為一體的專業(yè)性生物科技公司。目前公司銷售、代理：Invitrogen、Amersham、sigma、Aldrich、Amresco 、YOYOBIO、BD（Difco）、Thermo、Fluka、Merck、Omega、PALL、Millipore、Peprotech、Pierce、Roche、Eppendorf、 BioHiT、Whatman、Axygen、corning、Pharmaia、等諸多品牌。 0
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